专题一 基因工程

　　基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

　　(一)基因工具的基本工具

　　1. “分子手术刀”----限制性核酸内切酶(限制酶)

　　(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的(约4000种)

　　(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列(一般为6个核苷酸对组成的序列，少数是4个或5个，序列均为回文序列)，并且使每一条链种特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

　　(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

　　2. “分子缝合针”----DNA连接酶

　　(1)两种DNA连接酶(E-coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较：

　　①相同点：都缝合磷酸二酯键。

　　②区别：E-coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4-DNA连接酶能缝合两种末端，但链接平末端的之间的效率较低。

　　(2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

　　3. “分子运输车”----载体

　　(1)载体具备的条件：

　　①能在受体细胞中复制并稳定保存。

　　②具有一至多个限制酶切点，供外援DNA片段插入。

　　③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

　　(2)最常用的载体是质粒，他是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。(在基因操作中，真正被用做载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行了人工改造)

　　(3)其他载体：入-噬菌体的衍生物、动植物病毒

　　(二)基因工程的基本操作程序

　　第一步：目的基因的获取

　　1. 从基因文库中获取目的基因，包括基因组文库和cDNA文库。

　　2. PCR技术扩增目的基因(目的基因的部分序列已知)

　　(1)原理：DNA双链复制

　　(2)条件：模板DNA、两种引物、四种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、Taq酶。

　　(3)过程：变形：加热至90℃到95℃DNA解链;复性/退火：冷却到55℃到60℃，引物结合到互补DNA链;延伸：加热至70℃到75℃，热稳定DNA聚合酶从引物的3’端开始互补链的合成。

　　3. 反转录法获取cDNA

　　提取相应基因表达细胞中的mRNA，在逆转录酶的作用下反转录合成互补DNA(cDNA)，此DNA不含启动子、终止子、内含子。

　　4. 化学方法人工合成目的基因：基因较小，序列已知。

　　第二步：基因表达载体的构建(核心)

　　1. 目的：是目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，是目的基因能够表达和发挥作用。

　　2. 组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因

　　(1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。

　　(2)终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，终止转录。

　　(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。

　　第三步：将目的基因导入受体细胞

　　1. 转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

　　2. 常用的转化方法：

　　将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还是基因枪法和花粉管通道法等。

　　将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。受体细胞多是受精卵，也可以是核转植的重组细胞。

　　将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，其转化方法是：Ca+处理细胞—>感受态细胞—>表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合—>感受态细胞吸收DNA分子。

　　3. 重组DNA导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

　　第四步：目的基因的检测和表达

　　1. 首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。

　　2. 其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用用标记目的基因作探针与mRNA杂交。

　　3. 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。

　　4. 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

　　(三)基因工程的应用

　　1. 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

　　2. 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物(乳腺生物反应器)

　　3. 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。

　　(四)蛋白质工程

　　1. 通过基因改造，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程使生产自然界中不存在的蛋白质)

　　2. 过程：预期蛋白质功能--->设计预期蛋白质结构--->推测应有氨基酸序列--->找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。

　　专题2 细胞工程

　　(一)植物细胞工程

　　1. 理论基础(原理)：植物细胞具有全能性

　　2. 植物组织培养

　　(1)过程：离体的植物器官、组织或细胞--(脱分化)-->愈伤组织--(再分化)-->试管苗-->植物体

　　(2)用途：微型繁殖、作物脱毒(茎尖培养)、制造人工种子(包埋再分化产生的胚状体)、单倍体育种(花粉细胞做外植体)、突变体利用(对愈伤组织诱变)、细胞产物的工厂化生产(愈伤组织的细胞)。

　　(3)地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培养植物新品种的最后一道工序。

　　3. 植物体细胞杂交技术

　　(1)过程：酶解法去壁(纤维素酶和果胶酶)--原生质层融合--再生出细胞壁--组织培养

　　(2)诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。

　　(3)意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍

　　(4)缺陷：杂交植株还未能按照人们的医院表达出亲本的优良性状

　　(二)动物细胞工程

　　1. 动物细胞培养

　　(1)原理：细胞生长和细胞增殖。

　　(2)动物细胞培养的流程：取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)---->剪碎---->用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散称单个细胞---->制成细胞悬液---->转入培养瓶中进行原代培养---->贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散或单个细胞继续传代培养。

　　(3)细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分类生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制(癌细胞无接触抑制现象)

　　(4)动物细胞培养需要满足以下条件

　　①无菌、无毒的环境：培养液及用具应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞造成危害。

　　②营养：合成培养基的成分(糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分)

　　③温度和pH：适宜温度(哺乳动物多是36.5℃+0.5℃;pH：7.2~7.4.)

　　④气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的。CO2的主要作用是维持培养液的pH。

　　(5)动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备干扰素、制备单克隆抗体、检测有毒物质。

　　2. 动物体细胞核移植技术和克隆动物

　　(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)

　　(2)选用减数第二次分裂中期去核卵母细胞为受体细胞的原因：细胞质中具有促使细胞核全能性表达的因子。

　　(3)应用：

　　①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育

　　②保护濒危物种，增大存活数量

　　③用于组织器官的移植等。

　　(4)体细胞核移植的大致过程是：

　　也可以将供体细胞直接注入到去核的卵母细胞中去，优点是对细胞核伤害小，易操作。

　　(5)体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷。

　　3. 动物细胞融合

　　(1)动物细胞融合也成为细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

　　(2)动物细胞融合与植物原生质体融合原理相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电磁等

　　(3)动物细胞融合的意思：克服了远缘杂交不亲和性，主要用于单克隆抗体的制备。

　　(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

　　4. 单克隆抗体

　　(1)抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

　　(2)单克隆抗体的制备过程的两次筛选：第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞;第二次用细胞克隆化培养和专一抗体阳性检测的方法筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

　　(3)杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

　　(4)单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可能大量制备。

　　(5)单克隆抗体的作用：①作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。②用于运载药物：主要用于治疗癌症，可制成“生物导弹”。

　　专题三 胚胎工程

　　(一)动物胚胎发育的基本过程

　　1. 胚胎工程包括胚胎移植、体外受精、早期胚胎培养、胚胎分割、胚胎干细胞等技术。

　　2. 精子、卵子的发生和受精作用

　　(1)精子的发生：雄性哺乳动物从初情期到生理机能衰退，在睾丸的曲细精管内产生。精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂;变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾部形成线粒体鞘，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。[线粒体为精子运动提供能量]

　　(2)卵子的发生：在雌性动物的卵巢内完成。胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂，进一步演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围]，减数第一次分裂在排卵前后完成，减数第二次分裂是在受精过程中完成的，受精场所在输卵管。卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前完成，这是精子和卵子在发生上的重要区别。

　　(3)受精：①准备阶段：精子获能(在雌性动物生殖道内);卵子的准备(卵子要在输卵管中成熟减数第二次分裂中期才具备受精能力)②受精阶段：精子穿越放射冠和透明带、精子进入卵细胞膜、雌雄原核形成并融合。

　　顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。

　　防止多精入卵的两道屏障：透明带反应(精子触及卵细胞膜的瞬间发生)和卵细胞膜反应(精子入卵后的瞬间)

　　[注意：受精的标志是形成第二极体;受精成功的标志是雌雄原核融合成合子]。

　　3. 动物胚胎发育的基本过程

　　(1)卵裂期(在透明带内进行)特点：细胞有丝分裂，细胞数目不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。

　　(2)桑葚胚：胚胎细胞数目达到32个左右时，形似桑葚。是全能细胞，此时未分化。

　　(3)囊胚：细胞开始出现分化，聚集在胚胎一端的较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。外层是滋养层细胞，将来发育成胎盘和胎膜。

　　(4)原肠胚：特点是有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。

　　(二)胚胎干细胞

　　1. 哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎(如囊胚的内细胞团)或从原始性腺中分离出来。

　　2. 在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显;在功能上，具有发育的全能性。可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

　　3. 胚胎干细胞的主要用途：

　　①可用于研究哺乳细胞个体发生和发育规律;

　　②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛磺酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;

　　③可用于治疗人类某些顽疾

　　④利用ES细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞的特征，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能

　　⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，可以培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官移植后免疫排斥的问题。

　　(三)胚胎工程的应用

　　1. 体外受精和胚胎的早期培养

　　(1)卵母细胞的采集和培养：

　　主要方法：用促性腺激素处理，使其排除更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精，第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;第三种方法时借助超声波探测仪、内窥镜、腹腔镜等工具直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。

　　(2)精子的采集和获能：在体外受精前：要对精子进行获能处理。通过采用培养法(啮齿动物、家兔和猪)和化学诱导法(牛、羊)。

　　(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

　　(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，已检查受精情况和受精卵的发育能力。培养液成分包括无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存，不同动物胚胎移植的时间不同。(牛羊一般要培育到桑葚胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在8至16个细胞阶段移植。)

　　2. 胚胎移植

　　(1)胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方法获得到的胚胎，移植到同种的生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的称为“受体”。(供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。)

　　地位：如转基因、核移植或体外受精等任何一项胚胎工程所产生的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。

　　(2)胚胎移植的意义：大大缩短了工体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁育能力。

　　(3)生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对一如子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体内的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理与组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

　　(4)基因程序主要包括：

　　①对供、受体的选择个处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁育能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

　　②配种或人工授精

　　③对胚胎的收集、检查培养或保存。配种或输精后第七天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑葚或囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氨中保存。

　　④对胚胎进行移植。

　　⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。

　　3. 胚胎分割

　　(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等分、8等分等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

　　(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。

　　(3)材料：发育良好，形态正常的桑葚胚或囊胚。(桑葚胚至桑胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。)

　　(4)制作过程：对桑胚的胚胎分割时，是将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

　　(5)存在问题：刚出生的动物体重偏低、毛色和斑纹上存在差异。

　　专题四 生物技术的安全性和伦理问题

　　(一)转基因生物的安全性争论：

　　(1)基因生物与食物安全：

　　反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变

　　正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据

　　(2)转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响

　　反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”

　　正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、划分存活时间有限

　　(3)转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响

　　反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体

　　正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境

　　(二)生物技术的伦理问题

　　(1)生殖性克隆和治疗性克隆

　　中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。

　　(2)试管婴儿和设置试管婴儿(都需要申请才可实施)

　　试管婴儿是为了治疗同胞兄弟姐妹的疾病，在胚胎移植前要进行遗传学诊断。

　　(3)基因身份证：

　　否定的理由：个人基因咨询的泄露造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。

　　肯定的理由:通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。

　　(三)生物武器

　　(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。

　　(2)散步方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。

　　(3)特点：致病力强、多数具传染性、传播途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。

　　(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度：不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。

　　专题五 生态工程

　　1.生态工程实例分析